膠體金法檢測平臺

膠體金結(jié)構(gòu)圖

什么是膠體金？

膠體金（colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，金離子還原后聚合成的一定大小的金顆粒，它由一個基礎(chǔ)的晶核（11個金原子形成的二十面體）和包圍在外的雙離子層構(gòu)成（內(nèi)層為負離子層AuCl2-,外層是帶正電荷的H+）。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，故稱膠體金。膠體金具有高電子密度，能與多種生物大分子結(jié)合，已成為繼熒光素、放射性同位素和酶之后，在免疫標記技術(shù)中較常用的一種非放射性示蹤劑。膠體金的粒徑一般在1-100nm之間，能夠均勻、穩(wěn)定地分散在液體中，呈球形小顆?；驒E圓形大顆粒。膠體金顆粒最外層可以吸附大量的正離子，能夠均勻分散在溶液中。

由于膠體金表面呈負電性，能夠與表面帶正電荷的抗原、抗體通過靜電作用進行標記。

膠體金法檢測原理

膠體金試紙條結(jié)構(gòu)圖

將特異性的抗體以條帶狀固定在膜上（T線），膠體金標記試劑吸附在結(jié)合上（金墊），當待檢抗原加到試紙條一端的樣本墊上后，樣本通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。

膠體金技術(shù)優(yōu)勢與不足

優(yōu)勢

快速：所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成；
操作簡便：便于個人自測或醫(yī)院檢測；
成本低：不需要特殊的儀器設(shè)備；
穩(wěn)定性好：試劑效期可達兩年或更長時間；

缺點

較ELISA、化學(xué)發(fā)光等方法靈敏度低；
易出現(xiàn)假陽性、假陰性；
存在HOOK效應(yīng)；

膠體金試劑條組成

膠體金試紙條主要由樣品墊、金墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙4個部分組成，從上至下依次首尾互相銜接，粘貼在PVC底板上。

作用

a. 樣品墊：檢測樣本滴加位置，對檢測樣本具有一定的過濾和緩沖作用，降低樣本中離子強度或酸堿度對檢測結(jié)果的干擾。

b. 金墊：將膠體金標記抗體通過干燥固定在玻璃纖維素膜上，是追蹤抗體與抗原的反應(yīng)。

c. 硝酸纖維素膜：膜上預(yù)先包被上檢測線和質(zhì)控線，能夠與膠體金標記物發(fā)生免疫反應(yīng)相結(jié)合，使膠體金在檢測線發(fā)生聚集，根據(jù)檢測線的顯色狀況進行判讀結(jié)果。

d. 吸水墊：通過吸水作用使液體樣品向上流動，帶動金墊的金標抗體向上移動，從而與檢測線的抗原發(fā)生反應(yīng)。

膠體金試紙條的制作過程

膠體金試紙條的制備過程

膠體金的制備

在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界限十分清楚。金顆粒表面帶有大量負電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成膠體金。膠體金的制備方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸-檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，目前常用后兩種方法。

檸檬酸三鈉還原法膠體金的制備流程

以下流程供參考：

a. 取100ml超純水倒入250ml錐形瓶中

b. 滴加1.0%氯金酸溶液1.0ml，置于磁力攪拌器中連續(xù)攪拌并加熱至沸騰

c. 攪拌下快速加入1.0%檸檬酸三鈉溶液1.8ml，此時溶液逐漸由淺黃色變成灰黑色最后變成橙紅色

d. 待溶液變?yōu)槌燃t色后繼續(xù)加熱15min

e. 冷卻至室溫，0.1mol/ml K₂CO₃調(diào)節(jié)溶液pH至6.5左右

f. 超純水定容至100ml后，置于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆?/p>

此時制備好的膠體金溶液應(yīng)為澄清透亮，顏色均一，無異物，無漂金現(xiàn)象。

注意事項：

1）玻璃器皿的清洗

制金前，玻璃器皿先用王水或鉻酸溶液浸泡24h，用自來水沖洗干凈，然后依次用清潔劑洗滌3次，自來水沖洗3次，蒸餾水沖洗3次，雙蒸水沖洗3次。

2）試劑的配制

必須使用雙蒸水。氯金酸溶液可以放在4℃保存1年左右，還原劑檸檬酸三鈉需要現(xiàn)配使用。

抗原/抗體診斷原料的膠體金標記

膠體金標記原理

在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負電荷，可與抗原/抗體所帶正電荷基團之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對所標記抗原/抗體的生物學(xué)活性無明顯影響。環(huán)境pH和離子強度是影響膠體金與抗原/抗體吸附的主要原因，膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及濃度等也影響蛋白質(zhì)的吸附。

膠體金標記流程

膠體金標記流程圖

注意事項

a. 膠體金最適pH的調(diào)整

用K₂CO₃或HCL溶液。原則上可選擇待標記抗原/抗體等電點，也可以略偏堿。但各標記物的最適反應(yīng)pH往往需要多次試驗才能確定。

b. 抗原/抗體最適標記量的確定

將待標記抗原/抗體作一系列稀釋后，加入裝有膠體金的試管中，然后分別加入NaCl溶液，混勻靜置數(shù)小時，對照管與加入蛋白量不足的管顏色會由紅變藍，而蛋白量足或超過的管保持紅色不變，其中含蛋白量最低的一管即為穩(wěn)定膠體金所必須的最適標記量。

c. 標記過程

在電磁攪拌器下降1/10體積的合適濃度的抗原/抗體溶液加于膠體金溶液，反應(yīng)一定時間后加入BSA并調(diào)整至pH8.0，放置至室溫繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘，封閉多余的游離膠體金，穩(wěn)定膠體金標記物。

d. 離心去除未結(jié)合的抗原/抗體，各粒徑的金粒子所需的離心轉(zhuǎn)速與時間均不一樣。

e. 離心后去上清，將沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)至原體積后再離心。

金標墊的制備

將標記好的金標復(fù)合物噴涂在玻璃纖維素上，在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。

樣品墊制備

將樣品墊處理液浸涂在玻璃纖維素膜上，在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。

印模制備

將硝酸纖維素膜（NC膜）貼在PVC底板上，將印模機的C、T線調(diào)整搭配合適的距離，然后進行印模，最后將印好的膜放在干燥間或烘箱中37℃將其烘干。

組板

將吸水墊和制備好的金墊、樣品墊裁切至合適的寬度，與印好C、T線的硝酸纖維素膜貼在PVC板的位置。

切條

根據(jù)檢測卡卡槽的寬度，將組裝好的大板裁切成一定寬度的檢測條，裁切寬度均一，無壓痕，無劃傷。

包裝

將裁切好的檢測條壓入檢測卡殼內(nèi)。

膠體金法檢測平臺

什么是膠體金？

膠體金法檢測原理